化合物活性筛选模型介绍——抗肿瘤、神经系统、心血管、代谢及皮肤疾病领域

2015-10-22

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从靶标可行性评估到临床前候选药物（PCC）确定，美迪西药物化学团队提供全流程、多领域的药物筛选与先导化合物优化服务，加速您的药物研发进程。

美迪西（Medicilon）与国内外客户长期开展药物研发合作，已成功推进多个临床前候选药物（Preclinical Candidate）的发现。我们的药物化学团队汇聚多学科专业人才，依托先进的实验平台与丰富的项目经验，为客户提供从早期发现到PCC确定的端到端服务。

新药靶标可行性评估

系统评估靶标的成药性（Druggability）、生物学相关性及临床转化潜力，降低新药研发早期风险。

高通量筛选（HTS）与活性化合物发现

基于丰富的化合物库与自动化筛选平台，快速识别具有生物活性的苗头化合物（Hit），支持基于结构设计的定向筛选策略。

活性化合物→先导化合物发现

通过多维度活性验证、选择性评估及初步成药性分析，将活性化合物推进为先导化合物（Lead Compound）。

先导化合物优化→PCC确定

系统性优化化合物的药效、选择性、药代动力学（DMPK）及安全性，直至确定临床前候选药物（PCC）。

计算机辅助药物设计（CADD）

运用分子对接、分子动力学模拟、药效团建模及虚拟筛选等技术，加速先导化合物发现与优化。

构效关系研究（SAR）

系统分析化合物结构与生物活性之间的定量关系，指导药物分子的理性设计与结构改造。

1. 抗肿瘤（抗炎）药物活性筛选平台

覆盖体外细胞毒、体内药效及关键信号通路的多层次抗肿瘤药物筛选体系，支持高通量、快速、准确的活性评价。

药物活性筛选

筛选模型	主要应用与特点
体外肿瘤细胞毒筛选模型	评价化合物对体外肿瘤细胞生长及增殖的抑制活性，可用于指导抗肿瘤活性单体的追踪分离。检测结果准确、重复性好，支持高通量筛选。
体内抗肿瘤药效评价模型（裸鼠移植瘤）	抗肿瘤药物研发的关键环节，综合反映药物体内作用效果，为评价化合物的成药性提供重要数据支撑。
一氧化氮（NO）生成抑制剂筛选	直接评价化合物抑制NO生成的活性，适合通量筛选，快速灵敏。可通过预刺激确证化合物是否作用于NF-κB信号通路。
NF-κB信号通路抑制剂筛选	应用双荧光素酶报告基因系统直接检测化合物对NF-κB信号通路的抑制作用，方法直接灵敏，是判断化合物作用机制的直接依据。
Wnt信号通路抑制剂筛选	应用双荧光素酶报告基因系统直接检测化合物对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用，检测快速、灵敏度高，支持高通量进行。
蛋白酶体抑制剂筛选模型	针对蛋白酶体复合物的核心20S催化颗粒进行筛选，直接评价化合物对蛋白酶体的抑制活性。检测靶点明确、快速、灵敏度高。
IκB激酶-β（IKK-β）抑制剂筛选模型	采用荧光比色法直接检测化合物对IKK-β激酶的抑制作用，靶点明确、方法快速、灵敏度高。
微管蛋白聚合/解聚筛选模型	通过荧光比色法直接针对微管蛋白的聚合和解聚过程进行检测，靶点明确、方法快速、灵敏度高。
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂筛选模型	通过荧光比色法直接检测化合物抑制HDAC的活性，靶点明确、方法快速、灵敏度高。

2. 神经系统药物活性筛选平台

覆盖阿尔茨海默病、脑缺血、癫痫、抑郁症及抗衰老等多个神经疾病领域的体内外筛选模型，支持从分子机制到整体动物行为学的多层次药效评价。

神经系统药物活性筛选

筛选模型	主要应用与特点
乙酰/丁酰胆碱酯酶（AChE/BuChE）抑制活性筛选	该模型以他克林（胆碱酯酶抑制剂）作为阳性对照，化合物与乙酰/丁酰胆碱酯酶的混合液在 30℃反应，乙酰/丁酰胆碱酯酶能够催化其底物类似物碘化硫代乙酰/丁酰胆碱降解，生成硫代胆碱和乙酸/丁酸，反应生成物与显色剂 DTNB反应生成黄色物质，在 405nm 处有特异光吸收。如果化合物对乙酰/丁酰胆碱酯酶有抑制作用，那么乙酰/丁酰胆碱酯酶催化底物类似物碘化硫代乙酰/丁酰胆碱降解的量就会减少，相应的与 DTNB 反应生成的黄色化合物减少，即在 405nm处的光吸收值变小，以此来筛选具有抑制活性的化合物。
促进PC12细胞分化活性筛选	该模型以未分化的PC12细胞为实验对象，采用包被培养方式，以NGF为阳性对照，化合物溶媒作为对照组，诱导72h后，显微镜下观察并记录PC12细胞分化情况，统计分析细胞分化率（轴索长度≥细胞直径的细胞百分数）、具有轴索的细胞数、细胞平均轴索数、梭形细胞比例等细胞分化的形态学参数，以此筛选出具有促进PC12细胞分化活性的化合物。
钙流活性筛选模型	该模型以细胞为检测对象，使用离子指示剂 Fluo 4-AM 作为细胞内 Ca2+的测定技术。Fluo 4-AM 是 Fluo 4 的一种乙酰甲酯衍生物（AM），通过培养，能够轻易进入细胞中。AM 进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生 Fluo 4，未结合的 Fluo 4 荧光很弱，与游离的钙离子(Ca2+)结合后产生强烈荧光。使用 Thermo Scientific 高内涵药物筛选仪，激发光 485nm，5s 检测一次，持续检测 5min，以荧光的变化来判定细胞内钙离子浓度的变化，从而评价化合物的钙流活性，为下一步的作用机制研究提供线索。
线虫长寿模型 I	该模型以 TJ356 线虫株为实验对象，TJ356 是 daf-16::GFP 转基因线虫株，正常情况下，daf-16 分布在胞质，当化合物作用于 Insulin-like 生长因子（IGF）信号通路时，daf-16 转入核内调控一系列基因的表达，在荧光显微镜下可见核内聚集荧光，由此可以确定化合物是否对于该信号通路有作用。
线虫长寿模型Ⅱ	该模型以 N2 线虫株为实验对象，通过固体培养方式，采用 FUDR 平板表面给药的方式，以不作任何处理的 FUDR 平板作为对照，挑入 L4 后期 N2 株线虫，20℃培养，统计两种平板培养方法下 N2 株线虫的寿命，能延长 N2 株线虫寿命的化合物，可能具有抗衰老活性。
抗脑缺血药效检测	候选药物配制成注射液，在大鼠再灌注后经注射给药。在给药 24 小时和48 小时检测大鼠行为，48 小时行为检测后快速取脑切片染色并计算缺血面积。与模型组相比，如果注射了候选药物的大鼠在行为评分或脑缺血面积上有所改善，则说明该候选药物可能对中风具有潜在的疗效。这是目前筛选治疗中风药物较为通用，也是较为可靠的方法。
抗老年痴呆药效检测（双转基因AD小鼠）	本模型用双转基因痴呆症模型小鼠（PrP-hApp/hPS1 双转基因 AD 小鼠）进行候选药物活性检测。该 AD 小鼠在 3 月龄出现认知行为学变化，5 月龄出现老年斑，12 月龄有大量老年斑形成。通过观察给药后 AD 小鼠在 Morris 水迷宫实验中的学习记忆能力，小鼠脑部 AChE 活性和 Aβ 含量来检测和评价候选药物抗老年痴呆能力，为候选药物的进一步临床研究提供充分的实验依据。
抗癫痫药效检测	本模型用生理盐水作为空白对照组，乙琥胺、丙戊酸钠及苯妥因钠作为阳性药对照组，采用给小鼠腹腔注射受试候选药物，30 分钟后皮下注射戊四氮，然后以“首次延迟 5 秒的 5 级癫痫发作时间、延迟 5 秒的 5 级癫痫发作次数及死亡情况”三个指标初步评判受试化合物的抗癫痫药效，为候选药物的进一步临床研究提供充分的实验依据。
抗抑郁药效检测	本模型用 C57BL/6J 小鼠作为研究对象，检测候选药物对小鼠在强迫游泳和悬尾情形下的行为反应。使实验小鼠在强迫游泳或悬尾的应激状态下持续 6分钟，通过视频软件分析、比较后 4 分钟的不动时间来评价候选药物的抗抑郁能力，为候选药物的进一步临床研究提供实验依据。

3. 心血管系统药物活性筛选平台

涵盖凝血三项检测与纯因子系统靶点验证的体外血液学活性筛选体系，精准评估抗凝血化合物的药效与作用机制。

心血管系统药物活性筛选

体外血液学活性筛选模型

凝血三项检测（APTT / PT / TT）

①活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT）统称为凝血三项，是评价化合物或候选药物体外抗凝活性的重要指标。其中，APTT主要用于检测化合物或候选药物对内源性凝血途径的影响，PT主要用于评价其对外源性凝血途径的影响，TT则用于判断其对共同凝血途径的影响。该药效学模型采用人质控血浆试剂盒法进行凝血三项检测，可用于筛选具有抗凝活性的化合物。

纯因子系统靶点验证

②血液凝固是由多种凝血因子依次激活所形成的酶促级联反应过程，即“凝血瀑布”。血浆中存在12种凝血因子，它们是血液凝固的重要物质基础。在纯因子系统条件下，通过研究抗凝血化合物或候选药物对各凝血因子活性的影响，可阐明其作用机制并明确相关靶蛋白。

本模型采用纯人源凝血因子系统，并结合显色底物法检测化合物对凝血因子活性的影响，从而解析其抗凝机制。目前主要评价指标包括：AT-III依赖的抗凝血因子Ⅱa和Xa活性、HCII依赖的抗凝血因子Ⅱa活性、抗凝血因子Xase酶活性以及活化凝血因子Ⅻ活性。

4. 糖尿病/代谢性疾病药物活性筛选平台

覆盖胰岛素增敏、SGLT2抑制、减肥及抗胰岛素抵抗四大方向，靶点明确、适合批量筛选的代谢性疾病药物评价体系。

治疗糖尿病/代谢性疾病药物活性筛选

a. 胰岛素增敏活性筛选模型

胰岛素（Insulin）作用于肌肉和脂肪细胞后激活其信号通路，从而调动葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）从胞内向胞膜转运进而完成葡萄糖摄取。不同的胰岛素刺激浓度和 GLUT4 在胞膜上的表达量呈线性关系，故而检测 GLUT4 的膜转运率即为检测胰岛素敏感性的指标。

该模型采用过表达 GLUT4 的脂肪细胞作为检测模型，量化化合物处理后GLUT4 在细胞膜上的分布量。利用 NIKON Ti-E 荧光显微镜和 Metamorph Offline。

软件实现对图像的全自动采集和数据分析。根据化合物的作用时间不同，该模型可以分为急性或慢性检测。此外，该模型具有灵敏性高、作用靶点明确等特点，是适合初步批量筛选胰岛素增敏活性的有效模型。

b. SGLT2葡萄糖重吸收抑制活性筛选

SGLT2全称为2型钠/葡萄糖共转运体,其生理功能是在肾脏近曲小管完成对原尿中约90%的葡萄糖重吸收。SGLT2抑制剂能够抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，通过增加尿糖排泄的方式降低机体血糖。同时，它不依赖于内源性胰岛素而发挥作用，降低血糖的同时能降低体重，是治疗糖尿病药物筛选中的一个新靶点。

该模型利用带发光基团的葡萄糖类似物 2-NBDG 作为指示剂（绿色发光），检测永生化的人肾近曲小管上皮细胞 HK-2 细胞的葡萄糖摄取情况。因此，该模型对被测化合物抑制 SGLT2 的活性具有提示作用。适合灵敏、批量，快速地初步筛选有抑制活性的化合物。根据化合物作用时间的不同，该模型可以检测化合物的急性或是慢性抑制活性。

c. 减肥活性筛选模型

在正常情形下，脂肪细胞数目到了青春期后就不再增加。成年以后发胖的人，一般是脂肪细胞因储藏过多脂肪而变大所造成。在人体内，脂肪是以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内的脂滴中。

油红 O(Oil Red O)是一种易溶于甘油三酯的染料，可以通过 Oil Red O 染色方法来判断脂肪细胞中脂肪的积聚水平。该模型采用分化成熟后的 3T3-L1 脂肪细胞作为检测模型，用 Oil Red O 染色法来检测脂肪细胞内甘油三酯的含量，从而判断化合物是否具有脂解作用，进而筛选出有减肥活性的化合物。该方法灵敏、简便、适合批量筛选。

d. 抗胰岛素抵抗活性筛选

胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）是胰岛素发挥作用的靶器官组织（如脂肪和肌肉细胞）对一定剂量胰岛素所产生的生理效应低于正常水平的一种状态，是2型糖尿病主要发病原因。该模型根据 2 型糖尿病中机体在维持较高胰岛素浓度的条件下仍然不能有效发挥其生理效应的特点，用高浓度胰岛素孵育脂肪细胞，引起其产生胰岛素抵抗。即在相同浓度的胰岛素刺激下，与正常细胞相比，产生胰岛素抵抗的细胞只能调动部分葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）上膜，不能有效完成葡萄糖摄取的功能。

利用该模型可直接评价化合物抗胰岛素抵抗的活性。根据化合物对细胞的作用时间不同，还可以分为急性或慢性检测。该模型灵敏、靶点准确，适合批量筛选。

5. 皮肤化妆品活性筛选平台

涵盖细胞毒性、抗氧化、美白及抗衰老等多维度的化妆品活性成分评价体系，助力功能性化妆品原料开发。

皮肤化妆品活性筛选

a. B16 / HDFa 细胞毒性实验（MTS法）

通过 MTS 比色法，确定样品的 CC50 (50% cytotoxicconcentration)，即对50%的细胞产生毒性时的药物浓度，从而确定以下活性实验的安全样品浓度。细胞与样品共同孵育后，加入 MTS 试剂，MTS 是一种新合成的四唑类化合物，能够被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数在一定范围内呈高度相关，通过酶标仪测定其490nm下的吸光值以确定细胞的存活率。与MTT 方法比较，MTS 比色法更加灵敏简便，快速安全。

b. DPPH自由基清除实验（抗氧化）

当自由基超过人体的抗氧化防御能力时，受损的分子和细胞就会急剧增多，氧化损伤随之产生，进而可能导致炎症、癌症的发生，还会引起皮肤干燥、暗黄、松弛、产生皱纹等。因此筛选具有清除自由基活性的天然产物对于抗衰老化妆品的开发具有一定的意义。

本实验利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）法来评价样品的体外抗氧化能力。DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，在515nm处有强吸收峰，当有自由基清除剂存在时，DPPH 会和清除剂提供的质子结合形成 DPPH-H，从而使溶液颜色由紫色变为黄色，在 515nm 处的吸光度变小。以此来筛选具有体外抗氧化能力的天然产物。

c. 酪氨酸酶活性抑制实验（美白）

酪氨酸酶是黑色素生成过程中的主要限速酶，其活性与黑色素的合成量成正相关。研发能抑制酪氨酸酶活性的物质将成为治疗色素沉着性疾病的重要手段。

多巴在酪氨酸酶催化下转变为多巴醌，多巴醌有两种代谢途径，第一种继续转变为黑色素，第二种与半胱氨酸相互作用后转变为褐黑素。样品如果能够抑制酪氨酸酶的活性，即可间接抑制黑色素的生成，并且在 490nm 处的吸光值会变小，据此筛选具有抑制酪氨酸酶活性的样品。

d. B16细胞黑色素生成抑制实验

黑色素是由黑素细胞合成分泌的，广泛存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等处，黑色素分泌失调容易导致雀斑、黄褐斑、黑变病等疾病，因此筛选具有黑色素抑制活性的天然产物对于美白化妆品的研发具有重要意义。

本实验所选细胞为小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞），因为B16细胞的基本结构，特别是黑色素合成功能与人体正常的黑素细胞基本一致，因此B16细胞可作为比较理想的筛选模型。黑色素在 405nm 处有强吸收峰，当样品抑制 B16 细胞黑色素分泌时，吸光值会减小，以此计算黑色素生成抑制率。

e. 促胶原蛋白分泌实验（抗衰老）

胶原蛋白是动物体内最丰富的蛋白，占人体皮肤蛋白质的 71.2%。皮肤中一旦缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生交联固化，细胞间黏多糖减少，皮肤失去弹性并变薄老化，因此筛选能够促进胶原蛋白分泌的天然产物对于抗衰老化妆品的研发具有一定的意义。

皮肤中主要以 I 型胶原蛋白为主，而 I 型胶原蛋白的分泌水平可以通过I型前胶原蛋白的分泌水平体现，所以本实验通过检测I型前胶原蛋白的方法来计算I型胶原蛋白的分泌增加率。

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