双分子荧光互补技术服务

双分子荧光互补技术（BiFC，Bimolecular Fluorescence Complementation）是一种可在活细胞内直观、快速检测目标蛋白之间相互作用的技术，由 Hu 等人于 2002 年首次报道。美迪西已建立并完善了 PROTAC 生物筛选与功能验证平台，其生物部具备成熟的 PROTAC 功能检测与验证能力，可利用融合蛋白表达、双分子荧光互补（BiFC）等技术开展 PROTAC 的高通量筛选与功能验证，用以发现能够靶向降解目标蛋白的 PROTAC 分子。

一、双分子荧光互补（BiFC）技术原理

有研究表明，GFP的两个β片层之间的环状结构（loop）上存在多个可插入外源蛋白的位点，且在适当条件下不会显著影响GFP的荧光活性。双分子荧光互补（BiFC）技术正是利用荧光蛋白的这一特性，将荧光蛋白分割成两个本身不具有荧光活性的片段，并分别与目标蛋白融合表达。

当两个目标蛋白发生相互作用并相互靠近时，与其融合的两个荧光蛋白片段也会在空间上相互接近，从而促进两个片段重新组装，恢复荧光蛋白的荧光活性并产生荧光。通过荧光显微镜，可以直观观察两个目标蛋白是否发生相互作用，并在接近活细胞生理状态的条件下，观察蛋白质相互作用发生的时间和位置，以及荧光信号强度等信息。此外，BiFC还可用于分析蛋白质复合物的形成及稳定性，以及细胞信号分子对蛋白质相互作用的影响。这些信息对于研究蛋白质相互作用及其调控机制具有重要意义。

在此基础上发展出的多色双分子荧光互补技术（multicolor BiFC），不仅可以同时检测不同蛋白质复合物的形成，还能够比较不同蛋白质之间相互作用的相对强弱。该技术对实验设备和蛋白质表达比例的要求相对较低，具有操作直观、适用范围广等特点。因此，BiFC技术已被广泛应用于活细胞内蛋白质相互作用的研究。

二、BiFC 技术六大核心优势

BiFC 技术在蛋白质相互作用研究中具有独特优势，主要体现在以下六个方面：

BiFC 技术具有操作相对简单、检测直观等特点，可应用于原核生物、真菌、植物和动物等多种生物体系及细胞类型，是研究活细胞内蛋白质相互作用及蛋白质复合物形成的重要工具。

三、BiFC 实验流程与服务步骤

标准的 BiFC 实验流程主要包括以下2个步骤：

1 载体构建
将目的基因分别克隆至含荧光蛋白 N 端片段（VN）或 C 端片段（VC）的表达载体中，构建目的蛋白与荧光蛋白片段的融合表达载体。

2 细胞共转染
将构建好的融合表达载体共同转染至合适的宿主细胞中，荧光显微镜下观察是否有相互作用。

四、典型应用实例：转录因子互作研究

Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155.

CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) together with ECFP. JunΔL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Student’s t test, p<0.05.

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