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【Science速递】攻克COVID-19里程碑:已确定血凝块形成原因!

作者:medicilon   上传日期:2020-11-15  阅读次数:

COVID-19患者存在血栓性动脉和静脉阻塞的高风险,SARS-CoV-2感染可通过多种可能的协同机制导致大血管和微血管血栓形成,其中包括激活白细胞、内皮和血小板的细胞因子风暴;缺氧性血管闭塞,并通过病毒感染直接激活免疫和血管细胞。在COVID-19中,微观凝块可能会限制肺部的血液流动,从而损害氧气交换。
抗磷脂综合征是一种获得性血栓形成症,患者会产生针对磷脂和磷脂结合蛋白(aPL抗体)的致病性自身抗体,这些自身抗体接合的细胞表面激活内皮细胞、血小板和嗜中性粒细胞,从而使血液-内皮界面向血栓形成方向倾斜。抗磷脂综合征的一个关键特征是它能够促进各种大小血管床(包括动脉和静脉回路)血栓形成的能力。抗磷脂综合征的灾难性变体通常是致命的,并且与COVID-19患者所见的弥散性凝血病具有某些相似性。
在近日的《Science Translational Medicine》上发表了一篇文章,研究人员发现一大半患严重COVID-19的患者表现出高水平的危险抗体和超活化嗜中性粒细胞,这些都是具有严重破坏性的白细胞。研究人员表示“来自活跃COVID-19感染患者的抗体在动物体内引起了惊人的凝结,这是我们见过的最严重的凝结。”为了了解更多信息,研究人员在小鼠模型中一起研究了中性粒细胞和COVID-19抗体,以查看这是否可能是血块背后的危险组合,最终发现了使COVID-19的患者血凝的机制。

研究人员在小鼠模型中一起研究了中性粒细胞和COVID-19抗体,发现了使COVID-19的患者血凝的机制

住院COVID-19患者血清中aPL抗体的患病率
研究人员对172例接受住院治疗的COVID-19患者的血清样本进行了八种不同类型的aPL抗体评估,在测试的各种aPL抗体中,aPS / PT IgG的患病率最高(24%),其次是aCL IgM(23%)和aPS / PT IgM(18%)。41位患者(24%)的一种以上aPL抗体呈阳性,13位患者(8%)的两种以上aPL抗体呈阳性,52位患者(30%)至少具有一种中高滴度aPL抗体。36位患者在多个时间点采集的血清样本可用于aPL抗体测试,从而可以进行纵向分析。使用最高的aPL抗体血清滴度对这36例患者进行阳性分类,为了进一步阐明在aPS / PT抗体呈阳性的血清样本中自身抗体的抗原特异性,研究人员在这些血清样本中测量了抗磷脂酰丝氨酸自身抗体(aPS抗体)。aPS IgG和aPS IgM均与aPS / PT抗体血清滴度无关,这表明COVID-19患者血清中的aPS / PT抗体主要识别凝血酶原。总之,大多数阳性血清样品与三种类型的自身抗体相关:aPS / PT IgG,aCL IgM和aPS / PT IgM。
aPL抗体的临床相关性
接下来,研究人员评估了aPL抗体与血氧饱和度、吸入氧分数、血清中C反应蛋白、血浆中D-二聚体浓度、血小板计数、绝对嗜中性粒细胞计数、血清钙卫蛋白(嗜中性粒细胞活化的标志物)和血清中髓过氧化物酶-DNA复合物。aCL IgM的滴度与所有这些临床和实验室变量相关,钙卫蛋白指示的血清中性粒细胞活化与aPL抗体的存在最一致。

aPL抗体、NET释放和肾功能

aPL抗体、NET释放和肾功能

然后,研究人员检查了与每个ELISA测试的阳性aPL抗体阈值相关的临床变量。任何aPL抗体的阳性试验均与血清中较高的钙卫蛋白(p = 0.009)和较低的临床估计肾小球滤过率(eGFR,p = 0.03)有关。当将患者aPS / PT抗体阳性的血清样本与该队列其余部分的血清样本进行比较时,也观察到这些关联(钙卫蛋白p = 0.0008;eGFR p = 0.008)或不含aPL抗体的血清样品(钙卫蛋白p = 0.001;eGFR p = 0.01)。有肾脏疾病史的患者的最低蛋白GFR低于无肾脏疾病的患者(p = 0.01)。与血清样品中缺乏aPL或aPS / PT抗体的患者相比,aPL或aPS / PT抗体阳性的患者的氧合效率趋于受损,尽管组间的比较没有统计学意义。同样,对于任何aPL抗体或抗PS / PT抗体呈阳性的患者,血清中的肌钙蛋白峰值和血浆中的D-二聚体峰值往往较高。鉴于肥胖会影响血浆中D-二聚体的浓度,研究人员比较了有无肥胖的COVID-19患者的D-二聚体血浆浓度,但没有发现差异。
从COVID-19患者血清中分离的IgG触发NETs的释放

COVID-19患者IgG在体外促进从正常嗜中性粒细胞释放NET

COVID-19患者IgG在体外促进从正常嗜中性粒细胞释放NET

鉴于最近检测到COVID-19患者血清中的NETs升高,研究人员认为从COVID-19患者血清中纯化的IgG组分可能会触发NET释放。研究人员选择了两名血清aPS / PT IgG高的COVID-19患者和两名缺乏血清aPL抗体的COVID-19患者,通过SDS-PAGE验证了COVID-19患者IgG的纯度。为了定量体外NET释放,研究人员测量了用微球菌核酸酶消化NET DNA后释放到上清液中的MPO活性。从健康个体中分离的嗜中性白细胞的NET释放增加了一倍(与未刺激的嗜中性白细胞相比),这类似于抗磷脂综合症(p < 0.0001)或灾难性抗磷脂综合症(p = 0.0001)患者的IgG样品在中性粒细胞中诱导的NET释放程度。先前已经证明,双嘧达莫是一种抗血栓药物,可以通过受体激动作用来减弱aPL抗体介导的血栓前NET释放。在这里,研究人员发现双嘧达莫还抑制了COVID-19患者IgG介导的NET从嗜中性粒细胞中释放,从aPL抗体阳性的COVID-19患者血清中纯化的IgG组分促进了NET释放,类似于从已建立抗磷脂综合征的个体中分离的IgG。
从aPL抗体阳性的患者血清中分离的IgG可增强小鼠血栓形成

来自COVID-19患者的IgG增强了小鼠的血栓形成

来自COVID-19患者的IgG增强了小鼠的血栓形成

接下来,研究人员试图确定来自COVID-19患者血清中的IgG是否可以加速血栓形成。在体外无细胞凝血酶生成测定中进行测试时,从COVID-19患者血清中纯化的IgG馏分没有明显的血凝块加速活性。尽管如此,研究人员推测在富含细胞的小鼠血管环境中仍可能观察到血栓前表型。首先将铜线放置在小鼠模型下腔静脉内,以通过电解介导自由基的生成。在该模型中,从IgG静脉注射后24小时,从血清中具有较高aPS / PT IgG血清滴度的COVID-19患者中分离出的IgG增加了血栓延伸和总体积聚。高aPS/PT血清滴度样品还增加了小鼠血清中的NET残留物(p= 0.0004),类似于来自灾难性抗磷脂综合征患者的IgG(p= 0.0014),并通过Western印迹法证明了在小鼠血栓中瓜氨酸化组蛋白H3(NETs的生化标记)表达更高的趋势。
结果与讨论
抗磷脂综合征最严重的表现是它的灾难性变体,在感染、手术或抗凝药撤离等应激条件时会影响少数患有抗磷脂综合征的患者。灾难性的抗磷脂综合症涉及炎症和血栓形成途径的紊乱,并同时影响体内的多个器官。在灾难性抗磷脂综合征患者中,受影响最常见的器官是肾脏、肺部、脑部、心脏、和皮肤。多器官功能衰竭肯定会使严重的COVID-19病例复杂化,而肺脏通常是受影响最严重的器官。研究人员推测由于病毒感染(包括潜在的内皮细胞感染)引起的局部免疫刺激可以与循环的aPL抗体协同作用,从而导致对COVID-19患者的肺部造成特别严重的血栓炎性损害。
来自抗磷脂综合征患者的血清样本以及纯化的aPL抗体会触发嗜中性粒细胞释放NETs,已在aPL抗体介导的大静脉血栓形成的小鼠模型中证实了这一观察结果的潜在体内相关性,其中中性粒细胞耗竭具有保护作用。来自抗磷脂综合征患者的嗜中性粒细胞似乎也具有增加的粘附潜力,这取决于整联蛋白Mac-1的活化形式。这种前黏附表型扩大了中性粒细胞-内皮的相互作用,增强了NET的形成,并潜在地降低了血栓形成的阈值。靶向NET形成的疗法具有治疗血栓疾病的潜力。在COVID-19中,aPL抗体的产生可能会增强NET的形成和BAFF的释放,这可以进一步提高磷脂反应性B细胞的存活和分化,并且在某些情况下可以类别转换为IgG同种型。COVID-19和体液免疫之间的相互作用显然是一个值得进一步研究的领域。
这些发现有一些潜在的临床意义,目前抗凝药和皮质类固醇激素在COVID-19的治疗中均显示出一定的前景。同时,恢复性血浆作为治疗COVID-19严重病例的一种方法也受到越来越多的关注。在当下等待针对当前COVID-19大流行的确定性抗病毒和免疫学解决方案时,测试aPL抗体(包括aPS / PT抗体)可能会改善COVID-19患者的风险等级和个性化治疗。研究人员表示还需要进一步研究aPL抗体对COVID-19的复杂血栓炎性环境的作用。
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