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美迪西质粒构建服务

作者:   上传日期:2016-04-06  阅读次数:

美迪西生物分析部提供全面符合FDA/OECD/CFDA GLP的生物分析服务,以支持小分子药物、生物制剂、疫苗和PD生物标记物的筛选与开发,及其临床前研究和临床研究。

美迪西分子生物学服务项目

质粒制备(准备)
亚克隆 
ORF克隆
基因突变
分子诊断

质粒构建服务

质粒构建服务流程

质粒构建过程

1、引物设计
2、目的片段选取:RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化
3、双酶切
4、连接:1)双酶切后,可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2ul;2)酶切产物液相纯化;3)20ul连接体系
5、转化
6、菌落PCR
7、测序:1)摇菌;2)送样; 3)比对 ;
8、菌种保存:菌种比对成功,则可保存菌种备用。
9、质粒提取:菌种比对成功,冻存菌种后,菌液用于提取质粒。

一、基本原理
分、切、连、转、筛

1、分:分离出要克隆的目的基因及载体。

2、切:用限制性内切酶切割目的基因和载体,使其产生便于连接的末端。
限制性内切酶:是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性,催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内切割,产生特异性DNA片段。时DNA重组技术中常用的酶。
Ⅰ型酶:具有修饰和切割功能,无固定切割位点
Ⅲ型酶与Ⅰ型类似,能识别特异位点,但切割位点在识别位点以外
Ⅱ型酶特点:
①识别顺序一般为4-6个碱基对
②识别顺序具有180度的旋转对称性,呈完全的回文结构
③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割,可产生两种不同末端:平末端,粘末端
平末端:在识别顺序的对称轴上,对DNA同时切割形成平末端,如:SmaI  
5’-CCC GGG-3’                           5’-CCC           GGG-3’
3’-GGG CCC-5’                           3’-GGG           CCC-5’
5′突出粘末端:在识别序列的两侧末端切割DNA双链,于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端,如:Hind Ⅲ 
5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’-AGCTT―3’
3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA-5’               A―5’
3′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反,产生3 ′端突出粘末端,如:PstI
5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA-3’               G―3’
3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’-ACGTC―5’
命名:酶来源的生物名称缩写
属名-种名-株名-发现次序
根据其来源命名。如:EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制
酶活单位定义:在适当的条件下(T,pH,离子强度等)一小时内完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的量,定义为1个活性单位。
目前常用的酶单位的定义是:37℃ ,1小时内50ul反应体系完全酶解1ugλ DNA所需的酶量。
在建立酶切体系时,酶的用量一般为1-5U/ugDNA。
   
3、连:将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。
①来源:T4DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD,。
②最佳pH7.2-7.8,常用的反应液为pH7.6的Tris-Hcl
③需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量
④DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用
⑤高浓度的钠、钾离子等抑制酶活性

4、转:把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程(细菌:E.coli,真菌:Yeast,昆虫细胞或哺乳动物细胞)。
5、筛:在不同层次上、不同水平上进行筛选,鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法,将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如:载体大小,酶切结果,筛选标记等。

二、操作步骤
①酶切产物回收
1. 将单一目的DNA条带切下,放入干净的ep管中,称取重量。
2. 向胶块中加入3倍体积的溶胶液PN(如胶块重量为100mg则加入300ul溶胶液PN),50℃水浴放置10min,间隔2min翻转ep管数次,以确保胶块充分溶解。
3. 胶块完全溶解后,溶液降至室温后将液体加入一个吸附柱(吸附柱放入收集管中),12000rpm离心30s,弃滤过液,将吸附柱重新放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW,12000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱重新放入收集管中。
5. 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW,12000rpm离心30s,弃废液,将离心吸附柱放回收集管中,12000rpm离心2min。将吸附柱室温放置5min彻底晾干。
6. 将吸附柱放入一个干净的ep管中,向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12000rpm离心1min。

②连接:连接体系一般为10-25ul,16℃连接过夜。


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邮箱:marketing@medicilon.com.cn

电话:02158591500


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