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用于基因治疗的病毒载体的纯化

作者:   上传日期:2018-01-04  阅读次数:

基因治疗是将遗传物质转移到患者的细胞中以达到治疗效果。治疗性DNA大部分是使用基于腺病毒(Ad),腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)等病毒载体系统进行递送。随着这些病毒载体作为临床治疗剂应用的增加,可扩展的商业化工艺(尤其是纯化)正在被研究和优化,以最大程度地确保关键质量属性(CQA)的保留。本文综述了病毒载体纯化技术及不同载体种类的不同特性对选择最佳单元操作的影响。

病毒载体的种类

每类病毒载体对基因治疗中都有自己的挑战与机会(表1)。腺病毒最初用于基因治疗是在20年前,但它们现在很少在临床应用(它们现在临床应用并不受欢迎),因为它们太复杂,比如具有挑战性的载体设计和系统管理,庞大的基因组,以及(最重要的)高免疫原性(1)。

慢病毒已经在临床试验中显示出应用前景,它们已经用于治疗Wiskott-Aldrich综合征,X连锁肾上腺脑白质营养不良和异染性脑白质营养不良(2–4)。慢病毒重要的作用机制(MoA)是它们能转导分裂和不分裂细胞的能力,从而产生持续的转基因表达和潜在的治疗效果。

AAV也被认为是一种有前景的基因治疗工具,因为它们没有致病性和免疫原性,同时具有持续转基因表达和适用于各种细胞的特点[5]。目前,西方国家唯一商业化的基因治疗是来自uniQure的Glybera(alipogene tiparvovec),其基于AAV1并已被用于治疗遗传性脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)。

表1.病毒载体综述
* AAV =腺相关病毒,HSV =单纯疱疹病毒,RCR =有复制能力的逆转录病毒,CNS =中枢神经系统(包括神经元和神经胶质细胞),VSV =水泡性口炎病毒,HFV =人泡沫病毒,DSP =下游工艺生物制造方面的考虑

基因治疗应用需要有可以生产高纯度和生物活性载体的大规模生产工艺,并且能满足化学,制造和控制(CMC)的监管要求。它们应该是稳定的、可扩大的、成本效益的,并且非常适用于多种病毒载体(6)。如图1所示,病毒载体的生产由上游和下游工艺过程组成,包括几个步骤,取决于产品的病毒特性。

用于基因治疗载体的病毒颗粒的上游工艺需要病毒生长和收获,而下游工艺侧重于病毒载体的纯化。值得注意的是,病毒载体的下游纯化占整体制造成本的大部分,并且是病毒载体制造的瓶颈(7)。可扩展的下游工艺包含澄清(微滤),捕获(超滤/渗滤),纯化(离子交换层析(IEX)和亲和层析(AF)),和精制(尺寸排阻层析(SEC)和超滤)等几个步骤。

由于每种病毒具有不同的生物化学和物理特性,所以病毒基因治疗载体的纯化必须根据各自特点做相应地调整。这个过程需要进行优化,以保持病毒感染性(与产品功效和典型的释放测定密切相关)并最大限度得到恢复。纯化方法的选择应该考虑病毒粒子大小和稳定性,中性pH下的电荷和相对粒子稳定性等特征。必须彻底了解纯化过程,以确定影响最终产品质量的关键步骤。
图1.病毒载体制备过程病毒载体纯化方法

病毒基因治疗载体纯化可以采取不同的方法,包括超速离心、膜过滤和柱层析法。后两者适合于工艺放大。

超速离心主要用于实验室规模,不能工艺放大,因为可用的转子通常只有小容量。超速离心经常导致活性病毒颗粒的丢失,病毒聚集和剪切力是可以用来解释的其中两种原因(8)。与膜和柱层析相比,超速离心的自动化也是个有挑战性的难题。它的使用会增加处理时间和产品降解的风险。

尽管柱色谱工具是可扩展的并且常用于生物分子纯化,但它们不适合纯化诸如DNA和病毒等的较大分子。在这种情况下,纯化通常通过0.1μm基质扩散来实现。

膜孔> 3µm的膜吸附器已成为流行的病毒纯化工具。它们将病毒颗粒吸附到固相上。由于孔径大,膜吸附器可以在更快的流速下工作,从而节约了的大量时间和商品成本(CoG)(9)。另一个优势是它们可以应用温和的洗脱条件,这增加了保留病毒感染性的可能性(6)。图2说明了如何利用膜吸附器实现病毒纯化,并用珠子作为对比。

图2:常规色谱与膜吸附的比较

纯化色谱的模式


色谱法可进一步分为四种模式,分别利用不同的机制实现病毒的纯化。IEX是基于位于病毒衣壳外部的蛋白质净电荷。AF利用基质偶联受体或配体与病毒衣壳之间的相互作用。SEC(凝胶过滤)根据大小将病毒从DNA,衣壳和蛋白质中分离出来。疏水作用层析(HIC)通过使用水性溶剂的疏水相互作用将病毒衣壳蛋白结合到基质上(10)。

基于载体种类的选择模式


由于每种载体具有特定的特征,所以某些纯化模式更易于发挥作用(表2)。为了纯化腺病毒,即Ad5,可以使用上述所有的色谱方法。由于Ad病毒在中性pH下带负电荷,因此可以使用各种阴离子交换吸附剂进行纯化。

表2. 载体纯化色谱产品
IEX =离子交换色谱; SEC =尺寸排阻色谱,AF =亲和色谱

使用阴离子交换剂的IEX也被报道用于几种AAV(11)。固定化金属亲和层析(IMAC)是可以纯化Ad的另一种方法。该方法基于将Ad颗粒与结合到柱上的带电锌离子结合。该方法为纯化AAV提供了几种选择,例如特别适用于AAV2纯化的肝素亲和层析(12)。SEC是适用于精制Ad和AAV5的方法,HIC可以用高浓度的硫酸铵和其他盐(13)来纯化Ad颗粒。后一种方法尚未被描述用于纯化AAV血清型(10)。

由于慢病毒带负电荷,所以纯化慢病毒的常规方法是使用膜吸附器和捕获步骤中使用的基于柱的AEX工具。这个步骤在不同的病毒载体纯化组中变化最大。慢病毒也可以通过使用肝素亲和层析来纯化,但是它引入了一种动物来源的试剂,在大规模的基因治疗生产中应该被淘汰[14]。最后,杆状病毒通常在捕获步骤中使用膜基阴离子交换剂,再用阴离子交换膜吸附剂和SEC来纯化。有进展,但依然有许多工作要做 基因治疗生物制备中的纯化技术的选择对终产品质量和CoG非常重要,而且是一个多因素的过程。虽然用于基因治疗的平台化生物工艺不断涌现,但它们尚未完全建立起来。

每个载体都需要进行彻底的表征和工艺开发。然而,传统的大规模纯化技术(特别是色谱方法)非常适合基因治疗生物工艺。因此寻求将基因工程方法中的新兴基础科学专业知识与已有的生物加工技能和技术相结合,以更好的服务于这个新兴行业。

我们掌握了建立可持续和可获利的基因治疗产业所需的工具和技术。但是手中的挑战是如何去最佳配置它们,以加速发展挽救生命和将有效的基因治疗应用到临床,而且还要有可以通过监管部门的数据和能够承担的成本。

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