新药发现阶段高通量ADME研究

在最近的十几年内，药物发现和开发的周期越来越长、成本越来越高。药物发现和开发的周期越来越长、成本越来越高。在西方国家，开发并上市一个新化合物实体需要10～15年时间，花费超过8亿美元。每10000个新化合物实体中，约有10个能进入临床研究阶段，但最终只有一个能够获批上市。即使已上市的药物，也可能因出现不可接受的不良反应而撤市。因此，新药研发是一个"高风险、低效率"的过程。创新药物的研发过程通常由3个阶段、4个步骤组成：

为了推动更多药物成功上市，通常可以采取两种措施：一是增加筛选化合物的数量，但这一方式受到经费、时间、资源和研发规模等条件的限制；二是提高新药研发的成功率，例如采用合理的药物设计策略，以及在药物发现阶段提前开展ADMET研究等。相比之下，提高研发成功率更受到研发机构和制药企业的重视。

1990年的一项回顾性研究发现，临床阶段失败的候选药物中，约40％是由于药代动力学方面的问题所导致。制药行业逐渐认识到，即使候选药物具有良好的靶点活性和选择性，如果其ADME特性无法满足类药性要求，最终仍难以开发成为真正的药物。因此，研究人员将原本处于药物发现后期的ADME研究提前至药物发现早期阶段，以便尽早淘汰不符合类药性要求的化合物，从而提高研发成功率。经过数十年的发展，2000年的统计结果显示，临床阶段失败药物中因PK问题导致淘汰的比例已显著下降。

在药物发现阶段开展ADME研究时，面临的主要问题包括：需要测试的化合物种类极为庞大（这主要得益于组合化学和平行合成技术的发展）、所涉及的实验项目繁多，而单个化合物可供测试的样品量却十分有限。因此，需要对现有测试方法进行微量化、自动化和高通量改造，使化合物测试速度能够与组合化学的合成速度相匹配。

此外，在实验流程设计方面，为了加快新药研发进程，研究人员逐渐采用平行（parallel）操作模式，将相关研究同步开展。传统上多采用顺序（serial）研究模式，即完成一项实验后再开展下一项实验，这种方式效率较低。未来的发展方向是将虚拟化合物库筛选与平行操作相结合，利用建立的构效关系，在无需实际合成化合物的情况下，对虚拟化合物库进行筛选，从而大幅节省研发资源并加快药物发现速度。

在药物研发过程中，ADME研究主要包括三类方法：虚拟方法（in silico）或计算方法（computational method）、体外方法（in vitro）以及体内方法（in vivo）。这三类方法各有其优缺点。

利用高通量筛选技术可以快速鉴别先导化合物，但通过组合化学构建的化合物库，首先是存在结构多样性差的问题，这降低了化合物开发的成功率；其次是化合物的类药性差，使大量的化合物在ADME筛选期间被淘汰，增加了实验成本。过去的20年，虽然药物发现阶段的新技术层出不穷，但每年上市的新化合物实体却没有实质性增加。另外，目前所建立的高通量测定方法多数与所试验的化合物结构类别有关，并不具有完全的通用性。

一、虚拟筛选方法

尽管目前已经开发出许多体内和体外微量化、简便化及自动化的实验方法，并在分析时间、劳动强度以及化合物处理数量等方面得到显著改善，但实验方法仍存在耗时长、成本高以及需要预先合成候选化合物等问题。虚拟筛选方法可作为一种替代策略，用于预测候选化合物的ADME特征，且具有高通量或超高通量的优势。

（一）小肠吸收预测

口服吸收与药物在胃肠道内容物中的溶解度、解离度以及跨越胃肠道细胞膜的能力密切相关。因此，化合物的理化性质是决定其小肠通透性的重要因素。提高药物口服吸收的预测方法主要包括以下几种：

1. 基于Lipinski的五规则(role of five)方法。

在化合物结构中，将N和O原子视为氢键受体，而将N—H、O—H基团视为氢键供体，并通过软件计算辛醇/水分配系数ClogP。若一个化合物满足以下两项以上条件：

● 氢键供体数>5

● 氢键受体数量>10

● ClogP>5

● 分子量（MW）>500Da

则该化合物会被标记为存在开发风险，其未来成药性可能存在问题。该方法不适用于存在主动转运机制的口服药物吸收预测。

2. 基于Lipinski“五规则”结合亲脂性与分子大小的方法

该方法同样基于Lipinski“五规则”，并结合化合物的亲脂性及分子大小信息，对化合物口服吸收过程中的被动扩散能力进行预测。通过将化合物的内在亲脂性参数ClogD（考虑生理pH条件下的解离情况）与反映分子大小的参数——计算分子折射率（calculated molecular refraction，CMR）进行作图分析，可将化合物划分为4个象限。

其中，第1和第3象限中的化合物具有适宜的亲脂性，能够较容易地进行跨膜转运；第2象限中的化合物分子较小且亲水性较强，可通过细胞间隙吸收；而第4象限中的化合物由于分子量较大且亲水性较强，跨膜吸收较为困难。因此，可根据化合物所在象限对其通透性进行预测。

3. 基于分子极性表面积（PSA）的方法

采用分子极性表面积（polar surface area，PSA）作为药物吸收的预测指标。研究表明，PSA及分子量与通过Caco-2细胞模型获得的表观通透性参数之间具有良好的相关性。

（二）血脑屏障(BBB)通透能力预测

在新药发现阶段，对于作用于中枢神经系统的药物，通常要求其具有一定的血脑屏障（BBB）透过能力；而对于作用于外周组织的药物，则要求其BBB透过能力尽可能低，以减少中枢神经系统不良反应。因此，需要对候选药物透过BBB的能力进行预测。

Van de Waterbeemd提出了一种BBB通透性预测方法：当化合物的分子量（MW）< 450 Da、极性表面积（PSA）< 90 Ų时，通常认为其具有较好的BBB透过能力。但该方法未考虑P-gp外排转运体的影响。

（三）代谢稳定性的预测

为了获得最佳生物利用度，药物不仅需要具有良好的吸收特性，还需要具备适当的代谢稳定性。目前研究表明，化合物的脂溶性、分子大小与形状，以及所含官能团的类型和位置，均会影响药物在体内的稳定性。其根本原因在于化合物的结构是否能够进入P450酶的结合与催化位点。

据报道，目前虚拟筛选方法的预测准确率约为60%～90%，且所采用的经验模型与化合物训练集密切相关。未来仍需采用更多结构多样化的化合物对模型进行验证，同时进一步阐明体内ADME机制，并建立基于机制的预测模型。

二、体外方法

在过去十多年中，体外方法已被广泛应用于药物通透性、生物利用度、代谢稳定性、药物相互作用以及药物理化性质等方面的研究与评价。体外方法的优点主要体现在以下两个方面：一方面，可通过微量化、自动化等技术手段建立高通量或中等通量筛选模型；另一方面，可利用来源于人体的组织、细胞或相关生物组分开展研究，从而减少人类与动物之间的种属差异，提高药物研发的成功率。

然而，体外研究缺乏体内环境中的血流、生化因子及多种转运蛋白等复杂影响因素。此外，在化合物配制过程中使用的有机溶剂，可能掩盖药物在体内的真实溶解特性，并影响药物代谢酶的活性。

（一）小肠吸收的评价模型

药物经口服给药后，需首先经过胃部的低pH环境，随后进入十二指肠和小肠，在溶出释放后通过小肠上皮细胞吸收入血循环。小肠上皮细胞对药物的吸收主要包括4种方式：跨细胞转运、细胞间旁路转运、载体介导的摄取以及载体介导的外排。

目前已开发出多种用于评价药物口服吸收的体外模型，常见的包括Caco-2细胞模型、MDCK细胞模型以及PAMPA人工膜模型。其中，PAMPA模型主要用于评价药物通过被动扩散方式的吸收，属于高通量研究方法；而Caco-2细胞模型和MDCK细胞模型则属于相对低通量的方法。

（二）代谢稳定性研究

药物进入体内后，作为外源性物质，会经历由药物代谢酶介导的生物转化过程。虽然某些存在于小肠上皮细胞中的P450同工酶（如CYP3A4）也可导致药物发生首过效应，但肝脏仍是体内最主要的代谢器官。

肝脏中存在多种药物代谢酶，包括Ⅰ相代谢酶，如P450酶以及非P450酶类（如酯酶、黄素依赖性单加氧酶和单胺氧化酶等）；还包括Ⅱ相代谢酶，如葡萄糖醛酸转移酶和磺基转移酶等。其中，P450酶是体内最主要的药物代谢酶系。

在P450同工酶中，CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4等均与药物代谢密切相关。其中，CYP3A4是P450酶系中含量最高、参与药物代谢比例最大的同工酶，参与代谢的药物约占总代谢药物数量的50%。

代谢稳定性是药物的重要性质之一。对于代谢稳定性较差的药物，通常需要频繁给药，才能维持有效治疗浓度。

由于药物代谢存在明显的种属差异，因此在药物研发阶段，采用来源于人体的组织或细胞进行研究，其结果通常更接近临床实际情况。在酶代谢稳定性研究中，常用的体外评价系统主要包括人肝微粒体和肝细胞。研究表明，人肝微粒体中P450酶的组成及比例与肝组织较为接近，且其易于保存，适用于高通量代谢稳定性研究；而肝细胞则含有完整的代谢酶体系，无需额外添加辅助因子，但存在保存时间较短、来源受限等问题。

（三）理化参数的确定

在药物发现阶段，候选化合物的理化参数（如溶解度、解离常数和亲脂性等）会影响药物的吸收、分布、代谢与排泄，因此有必要在药物发现早期对这些参数进行系统测定。目前，已经开发出多种高通量理化参数测定方法。

1. 溶解度

经典的溶解度测定方法为摇瓶法。由于测定过程中需要达到饱和状态，因此实验周期较长（最长可达7天），且样品消耗量较大，不适用于高通量研究。随后，人们开发了多种高通量溶解度测定方法，其中在药物发现阶段较常用的包括比浊法和紫外吸收（UV）测定法。这两种方法每天可测定数百个化合物的溶解度。

2. 亲脂性

亲脂性是指化合物或其部分基团对脂相环境的亲和能力，通常以化合物在两相体系中的分配行为表示，例如正辛醇/水分配系数。亲脂性可用于预测药物的膜通透性及代谢稳定性。

一般而言，化合物的亲脂性越强（如logD > 5），其膜通透性通常越高，也越容易在体内被肝药酶代谢；而亲水性较强的化合物（如logD < 0），则较难透过细胞膜，并更容易经肾脏排泄。通常情况下，理想药物的logD值多位于0～3之间，从而在溶解性与亲脂性之间达到较好的平衡。

常用的亲脂性测定方法包括摇瓶法，其原理是将待测化合物溶解于缓冲液中，并加入一种与水不互溶的有机溶剂。待体系达到平衡后，分离两相，并测定化合物在水相和有机相中的浓度。在特定pH条件下测得的部分解离状态下的分配系数通常以logD表示；若测定体系中的化合物不发生解离（如中性化合物），则所得结果以logP表示。

高通量亲脂性测定方法主要包括HPLC法，通过测定化合物在流动相与非极性固定相（如C18键合相）之间的分配行为，并以保留时间反映其亲脂性；此外，还可采用基于96孔板的紫外吸收测定方法。

3. 解离度

化合物的解离度有助于了解其在不同pH条件下的解离状态。当pH = pKa时，化合物约有一半处于解离状态。由于胃肠道及体内不同组织环境具有不同的pH值，因此会影响药物的解离状态，进而影响其溶解度、亲脂性、吸收特性以及与蛋白的结合能力。

传统的pKa测定方法主要为电位滴定法，但该方法通量较低、样品需求量较大，每天通常只能测定约10个化合物。另一种方法为毛细管电泳法，其样品需求量较少，但通量同样较低，每天约可测定10个化合物。

目前，高通量测定方法主要采用光谱梯度分析法（spectral gradient analysis，SGA）。该方法可结合96孔板进行分析，每天的检测通量可达到240个化合物。

为了评估药物之间潜在的相互作用风险，制药行业通常采用以下方法开展相关实验。

（四）药物相互作用研究

由于药代动力学相关的药物相互作用，已有多种药物被撤市。此类相互作用主要涉及两种机制：酶抑制和酶诱导。

1. 代谢酶的鉴定

明确参与药物体内代谢的关键酶，有助于评估待测药物与酶抑制剂或诱导剂之间的相互作用风险。例如，如果某种药物主要经CYP3A4代谢，则其可能与CYP3A4抑制剂（如酮康唑、红霉素和伊曲康唑等）或诱导剂（如利福平和苯妥英等）发生药物相互作用。

在药物相互作用研究中，可采用肝微粒体、重组表达的代谢酶系统以及肝细胞等体外模型。利用重组表达的代谢酶系统可鉴定参与药物代谢的具体酶种；通过将肝微粒体与特异性P450同工酶抑制剂联合使用，也可推测相关代谢酶；而利用人肝细胞与抑制剂联合研究，则有助于确定药物的代谢途径，因为肝细胞不仅含有Ⅰ相代谢酶，还含有Ⅱ相代谢酶。

2. 候选化合物对关键药物代谢酶抑制作用的评价

若某化合物能够抑制药物代谢酶，则可能与该酶底物药物发生药物相互作用。研究中通常采用肝微粒体结合特异性底物进行酶抑制实验，并根据测定得到的IC50或Ki值评估药物相互作用风险。

此外，也可利用重组表达的代谢酶系统或肝细胞开展相关研究。该类研究通常可采用高通量筛选方式进行。

3. 酶诱导潜力评价

若某药物能够诱导肝细胞中过度表达某种代谢酶，则其可能与该代谢酶的底物药物发生相互作用。此类研究通常需要采用活体原代肝细胞进行，实验周期一般为2～4天，因此属于低通量研究方法。

另一种常用方法是采用PXR-reporter细胞系进行研究，以提高实验通量。目前已知PXR（pregnane X receptor）是CYP3A4诱导剂的重要受体。当药物与PXR结合后，可激活相连的reporter基因，从而提示该药物可能为CYP3A4诱导剂。

此外，还需关注由药物转运蛋白介导的药物相互作用。同时，应对酶抑制机制进行分析，以区分竞争性酶抑制和机制依赖性酶抑制。据报道，机制依赖性酶抑制更容易引发临床药物相互作用。此外，对于Ⅱ相代谢酶抑制作用的研究也应予以重视。

三、体内方法

在药物发现阶段，动物体内研究在给药剂量、采血时间点以及实验动物数量等方面，与药物开发阶段的体内研究存在较大差异。在这一阶段，体内研究的主要目的在于优化先导化合物，并结合体外研究结果，为候选化合物的进一步开发提供依据和建议。

体内研究通常具有通量低、耗时长、样品需求量大及研究成本较高等特点，但由于其具备体外研究所无法完全模拟的血流动力学、生理生化因子及整体机体环境等影响因素，因此仍是新药研发过程中不可或缺的重要环节。

为了提高体内研究的通量，通常采取两种策略：一是提高样品分析速度，二是减少样品采集量。

（一）提高样品分析速度

在体内研究中，通常需要测定大量生物样品，因此提高分析速度是提升研究通量最常用的方法之一。样品分析方法主要包括HPLC和LC-MS/MS。由于待分析化合物的结构差异较大，因此所建立的方法需要具备较高的灵敏度和专属性。

传统HPLC方法由于方法开发周期较长、样品前处理步骤复杂，难以满足高通量分析需求。相比之下，LC-MS/MS因具有灵敏度高、专属性强以及样品处理简便（生物样品通常仅需进行蛋白沉淀处理）等优点，在样品分析中的应用日益广泛。但该方法仍存在基质效应干扰的问题。

另一种提高分析速度的方法是采用在线（online）固相萃取（solid phase extraction，SPE）技术，实现样品处理自动化。但该方法仍存在方法开发较为繁琐、整体分析时间较长等不足。

此外，还可采用湍流流动色谱（turbulent flow chromatography）技术提高分析通量。该技术可直接对血清、尿液等生物样品进行分析，而无需复杂前处理。其他提高分析速度的方法还包括采用MUX™系统进行并行LC-MS/MS分析。通常可同时使用4根色谱柱，并依次将各色谱柱流出液导入MS/MS离子源中。与单根色谱柱的LC-MS/MS系统相比，该方法的分析速度可提高近4倍。

在色谱柱选择方面，为缩短分析时间，可采用填料粒径更小的短色谱柱。采用此类色谱柱的液相色谱技术通常称为快速分离液相色谱。例如，使用细粒径短柱（2.1 mm × 20 mm，填料粒径为3 μm或更小）、通用快速梯度洗脱条件（有机相在2 min内由5%升至95%，流动相中含0.035%～0.05%三氟乙酸、0.1%甲酸或10 mmol/L乙酸铵）以及高流速（1～5 mL/min）等条件时，可将单个样品的分析时间缩短至约30 s。

（二）减少样品数量

在体内研究中，可采用盒式给药（cassette dosing）的方法减少样品数量：将几种药物合用，一次取样即可通过 LC-MS/MS 同时测定各药物的浓度。该方法的主要争议在于可能存在药物相互作用。

另一种方法是将数个含有不同药物的样品混合后一同测定；此外，也可将给药后不同时间点的血样等量混合，以粗略估计药物在体内的 AUC。

需要强调的是，应建立与测定速度相匹配的数据处理系统，并利用相应软件将数据生成便于决策者阅读和分析的报告。