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动脉粥样硬化动物模型制作过程——美迪西生物医药

2015-07-17
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 一、常用动脉粥样硬化动物模型的比较
动脉粥样硬化模型所用的动物有鼠、兔、猪、狗、猴,依上述理想动物模型的要求最常用的是兔、猪和鼠。各种动物诱导方法和形成特征的差异。

动物种类
疾病诱导方法
    特    征
自然发生,或高脂饮食 
高脂膳食高脂血症,肥胖
大白兔
高脂膳食 高脂血症,肥胖
血栓性血管壁损害纤维增厚,粥样硬化
新西兰兔
非剥离性内皮损害细胞纤维内膜增厚
 进行性病变,内膜增厚
高脂膳食,壁损害极似人类病变
高脂膳食 
高脂膳食好发冠状动脉硬化

二、动脉粥样硬化动物模型制作过程
主要介绍猪和兔两种动物模型的制作过程。因其容易获得、价格便宜、操作简单,常为首选动物。

1、猪的动物模型

健康雄性中国小型猪,按统计学需要,自定数量。5~6月龄,称其体重并记录,随机分为实验组和对照组,每组数量相等,单笼饲养,对照组只给基础饲料,实验组基础饲料每只动物按25g·kg-1/d分两次给予,上午在少量基础饲料中拌10%蛋黄粉和1.2%胆固醇,待吃完后再添足饲料。每月根据体重变化情况调整饲料量。两组均自由摄水。为使动脉粥样硬化模型更接近人的病变,可采用间接饲养法,于第17周停喂胆固醇和蛋黄粉4周,到第21周再恢复,并不再调整饲料量,直至第29周。

2.兔的动物模型

兔可选日本大白兔或新西兰白兔(常用作内膜剥脱造型)。8周龄或成年兔,称其体重记录,随机分组,单笼饲养。每日给胆固醇1.5g,上午以少量基础饲料拌食,待吃完后,再添足基础饲料(每日每只120g),对照组则只供基础饲料,两组均自由摄水,饲养10周。

以上均为高脂膳食法,此外还有一种较常见的造型法是剥脱内膜法,其操作是选用我国的大耳白兔,每天只给0.5g胆固醇和大油1.5g,蛋黄5g,1周后经右股浅动脉,将3.5F球囊扩张导管插至腹主动脉20cm,球囊充液膨胀至2个大气压缓慢拉出,反复3次。

三、相关指标检测

动脉粥样硬化的模型检测,大体包括病理形态学检查,免疫组织化学检查以及生化检查三个方面。

1.病理形态学观察
为了对比,猪在14~29周,兔在5~10周,处死两组动物(每周各一只),作饲养过程的经过观察。
(1)肉眼观察主动脉沿纵轴剪开,苏丹Ⅲ、Ⅳ混合染色,投影格子计数法分别计算每条主动脉内膜总面积,胸、腹主动脉内膜面积以及苏丹Ⅲ、Ⅳ染色阳性的脂质条纹及隆起的纤维斑面积,求出各类病变面积百分比。冠状动脉自心脏剥下,沿纵轴切开,苏丹Ⅲ、Ⅳ混合液染色,按上述方法计算每条冠状动脉内膜及其病变面积,求出病变面积百分比。在实验组(猪)14周时脂质条纹面积和纤维斑面积的百分比分别是9.64%和1.56%左右。冠状动脉在主支近端1/3处可见纤维斑。

(2)光镜观察从胸主动脉和冠状动脉典型病变处分别取材,常规石蜡切片,厚4μm,HE染色。用目镜测微尺于200倍镜下测量动脉纤维斑或脂质条纹的最大厚度及中膜厚度,求其厚度比值,两组的值应有显著的差异。Masson染色片,光镜下400倍计数三个视野的腹主动脉和冠状动脉左前降支纤维斑内胞浆红染的梭形细胞(视为平滑肌细胞)数。其值在两组间亦应有显著的差异。此外,尚可在实验组见到内膜缺损或裂隙。

(3)电镜观察动脉处死后迅速取材(部位同光镜),2.5g戊二醛及1%锇酸双重固定,常规制备样品,以超薄切片机切片,乙酸钠,柠檬酸铝染色,透射电镜观察。扫描电镜样品经逐级酒精脱水,临界点干燥,镀膜后观察。在动物模型组应见到内皮细胞变性坏死脱落,见到髓磷脂小体,细胞间连接变直变宽,内皮下间隙扩大,有较多的平滑肌细胞(SMC)和泡沫细胞。泡沫细胞胞质内密集成群分布的大脂滴和胆固醇结晶,结晶使细胞核移位,胞体肿大,部分泡沫细胞崩解,如图1所示。线粒体肿胀变性,多数SMC胞浆内充满大量细胞器(粗面内质网,高尔基体等)。但肌丝成分较少,间质可见弹力纤维增生,细胞外脂质沉积。

图1 猴大动脉硬化灶电镜图

喂饲一年形成的高胆固醇血症猴的大动脉呈高度动脉粥样硬化斑块(fatty streak)表面,内皮细胞呈复杂的凸凹不平。一部分细胞接合分离、巨噬细胞祼落、血小板粘着凝集。

2.免疫组化定性定位观察
目前市场上有多种免疫组化所需的抗原抗体提供,针对LDL的动脉粥样硬化斑可采用组化分析,用相应的LDL抗体为第一抗体的PAP法观察LDL在动脉粥样硬化病灶内的分布。LDL免疫活性阳性的颗粒主要分布在泡沫细胞周边,在纤维斑块内,LDL颗粒呈弥漫性分布,在病灶深部内弹力板附近,有大量LDL颗粒聚集成带状。

3.生化指标检测
在动物饲养全过程中,每周应进行一次血脂测定。可在耳垂静脉取血或心脏直接抽血。常测指标有血清总胆固醇(TC),某油三酯(TG),低密度脂蛋白(LDL),高密度脂蛋白(HDL),载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ),载脂蛋白B(ApoB)等,其动物模型,除ApoAⅠ和HDL外,其他各项指标与对照组比较出现不同程度的升高,尤其以TC、LDL、ApoB最为显著。此外,血小板膜流动性(PMF)及丙二醛(MDA)也可用作参考指标。

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